业内普遍估算，一次评价大约400万-500万元。

随后再将它们转导到细胞系中，生成失活或激活个别基因的细胞池张锋说，尽管所有的突变Cas9s都减少了脱靶效应，研究小组认为他们应该组合一些突变使得Cas9更具特异性。

尽管采用不同的向导RNAs效率存在一些差异，平均而言，这些突变体的效率与野生型Cas9相当，张锋说。例如，去年秋天他们发现了另一种DNA核酸内切酶Cpf1，Cpf1不同的切割功能使得它在某些情况下更有用。利用CRISPR发现未知的基因功能张锋说，CRISPR系统一个令人兴奋的特征就是向导RNAs的特异性。他们构建出了具有三个点突变的两种不同的Cas9突变体，发现我们能够在保留打靶活性的同时，进一步降低脱靶活性，以致我们不再能够检测到它，张锋说。有许多基因采用旧系统无法激活，这一新系统能够激活转录达100倍或1000倍，张锋说。

张锋说，他的研究团队正在继续提高这一系统的特异性。张锋的CRISPR基因敲除文库利用了靶向基因组所有保守编码外显子的向导RNAs。Oncorine（安柯瑞）Good science does not mean a good product自2013年以来，癌症免疫治疗领域取得飞速发展，其中溶瘤病毒免疫疗法是非常重要的分支之一。

他以3款药为例，总结了创新药研发过程中的3大个人体会。他说，这几年来，中国发表的论文和获得的专利快速增长，但是否具备了真正在中国做First-in-class药物的基础研究的条件呢？另一方面，要想发展创新药，国家必须要有与之匹配的监管科学以及支付体系。IBI308（信达PD-1抗体）To have an unique feature is critical for a product第三个例子，俞德超博士列举了信达生物在研的PD-1抗体IBI308。6月16日-17日，首届新药创始人俱乐部年会在苏州隆重举行。

尽管康柏西普在国内也取得了很好的销售成绩，但是就全球市场来看，这是很小的一部分。会上，信达生物制药（苏州）有限公司董事长兼总裁俞德超博士发表了题为Innovative Biologics in China: Opportunity Challenge的演讲。

IBI308与上市PD-1抗体对比俞德超博士表示，即使不能成为First-in-class药物，但如果能够将产品做出自己的特色，也会产生它的价值。总结报告的最后，俞德超博士分享了他对制药产业创新体系的看法，他认为需要考虑三方面的因素，即基础研究、监管科学以及国家支付体系。从康柏西普的开发经历，俞德超博士体会到的是：Choosing a right partner/investor means a lot for a great product。其中，今又生是全球第一个基因治疗药物，安柯瑞是全球第一个溶瘤病毒疗法。

目前，国际上已批准3种PD-1/PD-L1抗体，包括BMS的Opdivo、默沙东的Keytruda以及罗氏的Tecentriq。俞德超博士介绍，去年美国的AMD市场规模约为78亿美元，而中国的市场规模仅0.92亿美元。而事实上，早在2005年，我国就批准了世界上第一个溶瘤病毒（重组人5型腺病毒注射液，安柯瑞）上市，对治疗晚期鼻咽癌、膀胱癌等表现出非常好的疗效。2008年，康柏西普取得了非常好的临床一期结果，当时团队希望能够将产品推向美国市场，但这一想法并未得到公司大股东的认同。

报告中他分享了一些IBI308相关的数据（上图）。会上，信达生物董事长兼总裁俞德超博士发表了题为Innovative Biologics in China: Opportunity & Challenge的演讲。

但也有两个致命的弱点：1）患者体内存在Pre-existing antibody，即自然存在的抗药性。鉴于这一原因，这类药物通常不能够静脉给药，而是采用瘤内给药（intratumoral administration），受技术的要求，一般的护士不能做这样的工作，因此在市场推广方面存在很大的问题

他的研究小组还描述了其他的CRISPR/Cas系统C2c1, C2c2 and C2c3，并正在研究他们的机制。他们利用已知会落在一些特异脱靶位点上的向导RNAs来尝试了这种方法。而在改良及进一步操控CRISPR/Cas9这一工具使其更具特异性的同时，张锋课题组也在寻求发现新的基因编辑蛋白。利用CRISPR发现未知的基因功能张锋说，CRISPR系统一个令人兴奋的特征就是向导RNAs的特异性。为了证实这些筛查的效力，张锋课题组解析了黑色素瘤的耐药。而在RNAi筛查中，只有最高的击中点被证实。

张锋课题组通过结构分析揭示出，负电荷的非靶向DNA结合到了Cas9蛋白一个正电荷的凹槽中。5个Cas9突变体保留了对EMX1的靶向编辑活性，而将对脱靶位点的切割减少到1/10。

张锋说：我们认为如果我们可以中和其中一些正电荷，那么我们就可以减少不稳定性，由此使得Cas9更具特异性。有许多基因采用旧系统无法激活，这一新系统能够激活转录达100倍或1000倍，张锋说。

张锋说，他的研究团队正在继续提高这一系统的特异性。通过尝试组合各种向导RNAs变体与野生型Cas9，张锋研究小组发现在向导RNA上有一个所谓的种子区域赋予了特异性。

张锋将这些特异性增强型Cas9蛋白称作为eSpCas9变体。研究小组构建出了32个具有单个点突变的Cas9突变体，借助于已验证易错配的向导RNA将它们靶向EMX1基因。相比之下，新eSpCas9变异体扩展了这一种子区域。当DNA与向导RNA之间配对不完美时，Cas9核酸内切酶可诱导脱靶突变，这使得它不适合用于临床上精确地编辑基因组。

随后他们尝试验证了他们的新候选基因，并将他们的结果与以往完成的RNAi筛查进行了对比(Cancer Discov, 3:350-62, 2013)，发现他们可以证实顶部的几个CRISPR击中点赋予了vemurafenib耐药。近日，张锋在The Scientist网站的一次网络研讨会上，讨论了他的课题组在CRISPR/Cas9开发与应用前沿开展的研究工作。

这使得构建出可靶向所有基因或特定基因内多个位点的一个慢病毒CRISPR向导RNAs文库成为可能。随后该研究组尝试利用这些突变Cas9s切割了另一种基因VEGFA。

推荐原文：Screening with CRISPR。张锋说：我们认为这有可能是我们应用覆盖全基因组的文库来了解哪些基因赋予了肿瘤细胞对vemurafenib抗性的一次机会。

The Scientist：张锋畅谈其CRISPR/Cas9前沿性研究工作 2016-06-22 06:00 · angus 近日，张锋在The Scientist网站的一次网络研讨会上，讨论了他的课题组在CRISPR/Cas9开发与应用前沿开展的研究工作。当设计这些类型的筛查实验时，我们总是采用多个向导RNAs，确保我们有一些冗余，能够知道所有向导RNA的效应并非是由于脱靶改造所致。张锋的CRISPR基因敲除文库利用了靶向基因组所有保守编码外显子的向导RNAs。张锋说，尽管所有的突变Cas9s都减少了脱靶效应，研究小组认为他们应该组合一些突变使得Cas9更具特异性。

2013年，这位80后的年轻华人科学家开发出了可用来编辑DNA、敲除指定基因的CRISPR/Cas系统，自此之后一直致力于推动这一技术走向完美。例如，去年秋天他们发现了另一种DNA核酸内切酶Cpf1，Cpf1不同的切割功能使得它在某些情况下更有用。

尽管采用不同的向导RNAs效率存在一些差异，平均而言，这些突变体的效率与野生型Cas9相当，张锋说。测试大量的向导RNAs与具单个点突变的eSpCas9和具三个点突变的eSpCas9，科学家们发现两种eSpCas9能够以相似的效率编辑靶位点。

BRAF V600E是获得美国食品和药物管理局批准的药物vemurafenib (Zelboraf)靶向的一个癌症突变。然而，快速突变的细胞会对这一药物产生耐药，到接受药物治疗24周时肿瘤会再度复发。